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首页 > 技术平台 > 核心技术

        杭州高通量新药筛选中心(以下简称筛选中心)的核心技术是基于非标记、动态实时细胞分析检测(RTCA)。该技术采用微机械加工技术,在细胞培养板的每个细胞生长孔的底上设计了金微电极阵列,用以构建能实时、连续、定量跟踪细胞形态和增殖分化改变的细胞阻抗测试传感器,贴壁生长在微电极表面的细胞可引起贴壁电极界面阻抗的改变,从而可以获得细胞生理功能相关的生物信息,这种阻抗的变化可通过算法换算为细胞指数(Cell Index,CI)来表示。由于检测的指标是细胞状态改变而引起的电阻变化,所以就避免了细胞标记所引起的细胞生理状态的改变,为非标记的检测技术,检测原理见下图: 

图1 RTCA 技术检测原理

        如图1A所示为微电极上电阻的变化,当微电极阵列上没有细胞生长的时候,电阻为0,而随着细胞贴壁或细胞的扩增,电阻逐渐增高;图1B所显示的是一个细胞增殖试验的实例,图1B的左边是系统的软件将不同时间点的电阻变化换算成直观的细胞指数 (Cell Index,CI),图1B的右边即为不同时间显微镜下看到的细胞生长状况

        从图1中我们可以看出,随着时间的增长,CI的值不断增高,在早期(30min-4hrs),CI的增高主要是因为细胞贴壁后细胞形态发生改变所致,到42小时期间,CI的不断增高是因为细胞增殖所致,但到了72小时的时候,CI就不再增高了,表明细胞的生长已经进入了平台期。所以我们从上图可以看出,细胞的贴壁能力、细胞形态的变化及细胞数目的变化构成了CI值变化的三个主导因素。利用这一原理,理论上任何影响贴壁细胞这三个方面的因素,都可以引起CI发生改变,并通过微电极连续的反应出来。

        基于这一核心技术主要建设了实时细胞检测平台、实时心脏功能检测平台、实时细胞迁移和侵袭检测平台和全自动高通量筛选平台。

实时细胞检测平台

        利用实时细胞检测平台我们完成了6种药物筛选模型,分别是细胞增殖/毒性筛选模型、EGFR/RTK抑制剂筛选模型、G蛋白偶联受体(GPCR)相关药物筛选模型、细胞粘附相关药物筛选模型、变态反应性疾病相关药物筛选模型、NK细胞介导的细胞毒筛选模型。该技术不仅可以实时监测细胞的生长状况,还可以预测药物作用的某些可能机制(如图2所示),关于特征性生长曲线和药物作用靶点的联系的相关文章已经发表在Cell系列的子刊“Chemistry & biology”上,应用这一技术可以实现一次筛选可找到针对不同靶点的候选化合物,大大缩减了筛选所需时间,起到“一石数鸟”的作用。本中心利用这一核心技术对12万化合物进行的筛选及后续确证实验后得到的50个候选化合物,其中一个国家1.1类小分子化合物药物已经马上要进入II期临床,两个候选化合物正在进行结构修饰和临床前的研究工作,另外还有4个致DNA损伤、2个肝细胞生长因子抑制剂(HGFi)及2个抗有丝分裂的损伤候选化合物已经基本完成细胞水平的实验,准备进入动物实验评价疗效的阶段。


           
图2 不同作用机制的抗肿瘤药物在A549细胞上的特征性曲线

        如图2所示为一连续观察了68小时的细胞生长状态的曲线,对照组的A549细胞CI值随着时间的增长而不断升高,而加了药物的细胞CI值与对照相比均有下降,但是下降的幅度及形态各不相同,提示药物导致细胞毒性作用的机制不同
        Compound A:抗有丝分裂药物;Compound  B:致DNA损伤药物;Compound  C:细胞周期阻滞药物;Compound  D:影响细胞骨架蛋白的药物。

实时心脏功能检测平台

        利用实时心脏功能检测平台,我们可以高通量的实时无标记监测心脏细胞活性和QT延长。该系统将同时监测心肌细胞的搏动频率、动作电位变化、QT间期监测等,全面检测化合物或药物对心肌细胞的影响,准确预测药物的心脏毒性作用,为高通量心脏毒性评价成为可能,创新性的解决了国际技术难题。我们已经研究建立人多能干细胞诱导的心肌细胞筛选模型和小鼠原代心肌细胞筛选模型,根据不同作用机制的心脏毒性药物建立了特征曲线数据库,并已经开展了一系列新的化合物毒性筛选和心脏毒性评价,将为提高药物研发的成功率,节约药物研发的成本提供良好的支持。 

 
图3.采用RTCA心脏检测系统实时动态监测和记录诱导分化心肌干细胞活性和收缩特性

        如图3所示,多能干细胞接种以后可以看到随着时间的推移,CI值不断增高,到60小时后进入平台期,说明诱导分化的心脏细胞接近成熟期,从功能检测上可以看到心肌细胞收缩和跳动频率的变化

实时细胞迁移和侵袭技术平台

        实时细胞迁移和侵袭技术平台是巧妙的结合了我们的核心技术和Boyden小室的技术,精心的设计将细胞芯片放置在上室的背面以达到连续监测细胞迁移和侵袭过程的目地。该方法避免了标记对于细胞迁移的影响,并且不需要再通过计数或荧光方法来获得细胞迁移率的变化,极大的简化了实验过程,使利用这一技术我们可以筛选影响细胞迁移及侵袭的特性的化合物成为可能。如图4所示,是抗肿瘤药物Doxycycline影响细胞迁移的曲线。 

 
图4 应用实时细胞迁移技术监测Doxycycline对Hela细胞迁移的抑制作用

        如图4所示,随着Doxycycline浓度由低到高,Hela细胞的迁移能力明显下降,右图所示是根据曲线所作的作用后18小时的抑制细胞迁移的IC50。由于实验过程是实时监测,可以统计过程中任一时间点的IC50,获得更完整的实验数据

全自动高通量筛选平台
  
        全自动高通量筛选平台,对于大规模的化合物库的筛选,为了提高检测通量,避免人为操作的误差,我们进一步完善我们原有的HST系统,和Beckman公司合作开发全自动384孔板高通量筛选系统用于筛选。这一系统的成功研发将极大提高我们的药物筛选,特别是GPCR相关药物筛选的能力。

 
图5 全自动高通量系统监测组胺对Hela细胞的作用

        如图5所示,表达人组胺受体的Hela细胞接种在384孔板中(图5A),并用组胺刺激。组胺诱导产生了一个与肌动蛋白细胞骨架重排相关的瞬时的细胞信号(图5B)。对组胺浓度取对数与最大细胞反应做图,就产生了一个EC50值的剂量应答曲线(图5C)。384孔板的Z factor值可以达到0.65

        目前为止用利用我中心技术的文献报道日益增多,和我们合作的单位也越来越多,说明了这一全新的方法正在被越来越多的研究者接受。不久的将来在药物筛选和研发中这一核心技术的作用也会成为主要的技术方法,为药物研发提供有力的工具。